Quand le premier ornithorynque fut découvert, on ne savait pas que les femelles pondaient. On put le suspecter assez rapidement, mais le fait ne fut confirmé qu'en 1884 quand W. H. Caldwell fut envoyé en Australie pour cela et qu'après d'intensives recherches menées par 150 Aborigènes, il put découvrir quelques œufs.
L'ornithorynque atteint sa maturité sexuelle vers l'âge de 2 ans et n'a qu'une saison des amours par an avec un accouplement entre juin et octobre avec quelques variations dans les dates suivant les régions. L'accouplement a lieu dans l'eau. Les observations sur une longue période, le marquage et la recapture puis les premières études génétiques montrent la possibilité d'existences de populations sédentaires et de populations transhumantes, ce qui permettrait une polygamie des individus. Les femelles deviennent matures leur deuxième année et la période de fécondité dure plus de 9 ans.
À la naissance, les jeunes sont très vulnérables, aveugles et dépourvus de poils. Dès la sortie de l'œuf, les petits s'accrochent à la mère et elle les protège en s'enroulant autour d'eux. Comme pour les autres mammifères, la femelle allaite ses petits. Elle n'a pas de mamelons apparents, mais émet son lait à travers de petites ouvertures dans la peau (les pores). Ce lait s'amasse en gouttelettes accrochées aux poils de la mère que les petits ornithorynques lèchent quand leur mère est étendue sur le dos. Les jeunes vont ainsi passer 3 à 4 mois avec elle. Pendant toute la période d'incubation et les premières semaines d'allaitement, la femelle ne quitte son nid que pendant de courtes périodes pour aller se nourrir. En sortant de sa tanière, elle forme sur le trajet du tunnel plusieurs bouchons de terre qui ont certainement pour rôle de protéger les petits des prédateurs. Lorsqu'elle revient, elle doit les défaire et ce faisant, elle sèche sa fourrure, ce qui permet de maintenir le nid au sec. Au bout de 5 semaines, la femelle passe de plus en plus de temps hors du nid et, vers 4 mois, les jeunes vont sortir du nid pour la première fois.
